Контрастирование корпускулярных объектов

Корпускулярными объектами можно именовать частицы вирусов, фагов, выделенные клеточные составляющие (рибосомы, мембраны, вакуоли и т.д.), макромолекулы.

Одним из обширно всераспространенных способов контрастирования био объектов является оттенение металлами. В данном случае в особых вакуумных установках делается тепловое испарение металла. При всем этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямым траекториям. Встречаясь с Контрастирование корпускулярных объектов объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; его толщина будет больше в местах, перпендикулярных направлению полета частиц металла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени». Таким макаром , напыленная часть объекта обладает большей плотностью, чем напыленная подложка (фон), и потому объект будет виден. Этот Контрастирование корпускулярных объектов способ обширно применяется не только лишь для контрастирования вирусов, рибосом, да и для довольно тонких молекул нуклеиновых кислот. Минус этого способа в том, что он приводит к повышению размеров объекта на толщину напыленного слоя, который в наилучшем случае добивается 10-15 А. Другой недочет его в том, что он дает информацию только о наружном Контрастирование корпускулярных объектов виде и объеме частиц. Для контрастирования оттенением употребляется платина, палладий, их сплавы, уран.

При нехорошем контрастировании объектов смесями солей томных металлов используют молибденовокислый аммоний, уранилацетат, фосфорно-вольфрамовую кислоту (ФВК) (рис. 10). Если водные смеси таких веществ смешать с био объектами, а потом их нанести на пленки-подложки и высушить, то Контрастирование корпускулярных объектов объекты (к примеру, вирусы либо белковые комплексы) окажутся вроде бы погруженными в узкий слой бесформенного вещества высочайшей плотности. В электрическом микроскопе они смотрятся как светлые объекты на черном фоне (как фотонегатив). Достоинства способа в том, что растворенные соли могут просачиваться в глубь объекта и выявлять дополнительные его детали. Негативное Контрастирование корпускулярных объектов контрастирование обширно используется при исследовании вирусов, ферментных комплексов мембран. Нитчатые молекулы нуклеиновых кислот этим способом выявляются плохо из-за их малой толщины.

Соли томных металлов можно использовать при так именуемом положительном контрастировании. В данном случае контрастирующее вещество связывается со структурой, увеличивает ее электрическую плотность. Нередко для положительного контрастирования нуклеиновых кислот Контрастирование корпускулярных объектов употребляют смеси уранилацетата в спирте либо в ацетоне. Уранилацетат, контрастируя нуклеиновые кислоты, отлично прокрашивает центральные полости сферических вирусов, существенно увеличивает контраст рибосом и позволяет созидать тонкие нити выделенных нуклеиновых кислот.

Ультрамикротомия

При исследовании объектов в электрическом микроскопе появляется очередное отягощение – это их толщина. Дело в том, что при прохождении пучка Контрастирование корпускулярных объектов электронов через объект часть электронов поглощается, что приводит к нагреванию объекта и к его деформации. Потому нужно иметь тонкие объекты (не выше 0,1 мкм). Другое ограничение состоит в том, что даже если мы будем рассматривать неизменяющиеся объекты большой толщины (около 0,5-1 мкм), что в принципе может быть (к примеру Контрастирование корпускулярных объектов, в мегавольтном электрическом микроскопе, см. ниже), то на конечном изображении будут напластовываться проекции структур, располагающихся на различных уровнях по толщине объекта. Тем учить в трансмиссионных микроскопах внутреннее строение целых клеток плохо и неловко. Выход из этого положения аналогичен тому, что было найдено для световой микроскопии, - делать срезы очень Контрастирование корпускулярных объектов малой толщины, ультратонкие срезы (0,05-0,10 мкм).

Процедура их производства в принципе сходна стой, что употребляется в световой микроскопии. Клеточки и ткани для этого поначалу фиксируют. В качестве фиксаторов употребляются буферные смеси глутарового альдегида либо четырехокиси осмия. Более нередко применяется двойная фиксация: поначалу глутаровый альдегид, а потом осмий, который как тяжкий Контрастирование корпускулярных объектов металл контрастирует клеточные структуры. Потом, после обезвоживания, ткани пропитываются эпоксидными смолами либо другими пластиками в водянистой, мономерной форме. При полимеризации таких пластмасс пропитанный ими объект оказывается заключенным в твердые блоки, которые уже можно резать на тонкие срезы. Тут появляются две препядствия: где взять безупречные ножики, недостатки которых не сказывались бы при исследовании Контрастирование корпускулярных объектов клеток на практически молекулярных уровнях, и как сделать срезы шириной в сотые толики микрона. 1-ая задачка была решена таким макаром: оказалось, что совершенно острой и без зазубрин режущей поверхностью владеют сколы стекла (рис. 11). Но стеклянные ножики очень недолговечны, их употребляют только один раз. Используют алмазные ножики Контрастирование корпускулярных объектов: это особым образом заточенные маленькие алмазы, они служат в течение пары лет.

Неувязка производства сверхтонкого среза была решена тоже, казалось бы, просто – это тепловая подача объекта. Блок с заключенным в пластмассу объектом крепится на железном стержне, который греется и тем продвигает объект вперед на определенную величину за известное время. И Контрастирование корпускулярных объектов если эту тепловую подачу согласовать с ритмическими циклами резания, то можно получить серии срезов данной толщины. Это достигается при использовании особых устройств – ультрамикротомов. Есть конструкции ультрамикротомов, где подача объекта осуществляется механически.

Площадь получаемых ультратонких срезов обычно очень мала (0,1-1 мм2), потому все операции при ультрамикротомировании идут под микроскопичным контролем. Срезы, смонтированные на Контрастирование корпускулярных объектов сетках с подложкой, нужно дополнительно контрастировать – «окрашивать» при помощи солей томных металлов. В данном случае употребляют также соли свинца и урана, которые связываясь с внутриклеточными структурами на срезе, позитивно их контрастируют.

Техника производства ультратонких срезов открыла большие способности для внедрения электрической микроскопии практически во всех областях биологии и Контрастирование корпускулярных объектов медицины

Этот способ позволяет использовать цитохимические приемы на уровне электрической микроскопии: в этом случае нужно, чтоб продукты реакции были электронноплотными, отклоняли бы электроны. Не считая того, реакции не должны приводить к возникновению артефактных картин уже на ультраструктурном уровне. Число цитохимических способов в электрической микроскопии пока не велико, но это Контрастирование корпускулярных объектов направление активно разрабатывается.

В электронно-микроскопических исследовательских работах оказалось вероятным применить способы радиоавтографии. В данном случае употребляются сверхтонкозернистые эмульсии (величина гранул около 0,02-0,06 мкм). Недочетом этого способа является очень огромное время экспозиции, в неких случаях достигающие нескольких месяцев.

Все большее применение получают способы изготовления ультратонких срезов без фиксации и Контрастирование корпускулярных объектов заливки клеток в твердые пластмассы. Это способы криоультрамикротомии, т.е. получение срезов с замороженных тканей, мгновенно охлажденных до температуры водянистого азота (-196оС). При всем этом происходит фактически одномоментное торможение всех метаболических процессов, а вода из водянистой фазы перебегает в твердую, но не кристаллическую, ее молекулярная структура хаотична (стекловидное состояние). Такие твердые блоки Контрастирование корпускулярных объектов при температуре водянистого азота можно резать на ультратонкие срезы (ножик при всем этом также охлажден). Приобретенные срезы употребляют для выявления в их активности ферментов, для проведения на их иммунохимических реакций, для ферментативного переваривания и т.п.

Для проведения иммунохимических исследовательских работ употребляют антитела, связанные с частичками коллоидного золота, локализация Контрастирование корпускулярных объектов которого на продуктах и показывает на места расположения искомого антигена.

Исследование срезов, приобретенных на криоультратомах, показало, что общая структура и композиция клеточных компонент в этом случае не много отличаются от того, что видно при использовании хим фиксации и обыденных приемов получения ультратонких срезов. Как следует, те структуры, которые Контрастирование корпускулярных объектов имеют схожую композицию при различных способах обработки материала, по-видимому, близки к собственному прижизненному строению, не являются артефактными.

В пользу этого молвят данные по исследованию клеток при помощи других приемов электрической микроскопии.

Для исследования структуры разных мембранных компонент клеточки употребляется способ замораживания–скалывания. Он состоит в том, что объект Контрастирование корпускулярных объектов поначалу стремительно замораживают водянистым азотом, а потом при той же температуре переносят в специальную вакуумную установку. Там замороженный объект механическим методом скалывается охлажденным ножиком. При всем этом обнажаются внутренние зоны замороженных клеток В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность скола поочередно покрывается Контрастирование корпускулярных объектов узким слоем испаренного углерода, а потом металла. Таким макаром с замороженного и сохраняющего прижизненную структуру материала получают реплику с его скола (рис. 12). Потом уже в критериях комнатной температуры ткань либо клеточки растворяют в кислотах, но пленка-реплика при всем этом остается цела, ее изучают в электрическом микроскопе. Этот способ имеет Контрастирование корпускулярных объектов два достоинства: изучают высказывания со сколов нативных образцов; изучат рельеф поверхности мембран клеточки, что недостижимо другими способами. Оказалось, что и в данном случае общая организация клеточки и ее компонент сходна с тем, что мы лицезреем при хим фиксации либо при криотомии. Этот способ позволил узреть, что как на поверхности, так и Контрастирование корпускулярных объектов в толщине клеточных мембран размещаются глобулы интегральных белков, что мембраны не однородны по собственной структуре.

Способ получения реплик с микрорельефа эталона обширно используется при исследовании фибриллярных компонент клеточки. Так при исследовании цитоскелета клеток культуры ткани либо форменных частей крови клеточки обрабатывают детергентами для того, чтоб растворить Контрастирование корпускулярных объектов все мембраны. Это приводит к тому, что из клеточки вымываются все составляющие, не считая фибриллярных белковых компонент цитоскелета и материалы ядра. Такие препараты потом фиксируются, обезвоживаются и особым образом сушатся. Прямо за этим сухие препараты напыляются углеродом и контрастируются распылением томных металлов, после этого такая реплика снимается со стекла Контрастирование корпускулярных объектов, на котором росли клеточки, и просматривается в трансмиссионном электрическом микроскопе.


konsultaciya-dlya-roditelej-posobie-pozvolit-uspeshno-podgotovitsya-k-rabote-s-odarennimi-shkolnikami-otojti-ot.html
konsultaciya-dlya-roditelej.html
konsultaciya-i-prezentaciya-produkcii.html